【線上研討會】改善 Peptide mapping 分析工作流程：運用技巧降低偽陰/偽陽性結果

Merck 線上研討會 – 改善 Peptide mapping 分析工作流程: 運用技巧降低偽陰或偽陽性

“Peptide mapping” (胜肽圖譜分析)，用於全面鑑定蛋白質一級結構，也可區分蛋白質中變體、PTM 等確切位置。

近年隨著生物製藥學需求的增加，用於表徵這些複雜分子的分析方法也隨之增加。由於蛋白質的胺基酸序列是已知的，因此可以預測使用胰蛋白酶分解蛋白質時產生的片段，再透過 C18 逆相層析，分離不同的 peptide 大小（從單個胺基酸、二肽到更大的多肽），並將這些片段整合成「指紋」圖譜。

然而，由於蛋白質分解片段的複雜性，使得 peptide 圖譜分析，在層析環節上備受挑戰，過程中需要克服靈敏度低、峰形差和分離時間長等問題。這些問題常在使用 C18 逆相管柱時，牽涉到溶劑、離子對試劑選擇、管柱溫度、管柱化學選擇性等取捨。

本次研討會將針對上述不同面向，討論如何克服這些挑戰，並獲得快速、高靈敏度和可重現的 peptide 圖譜。

Yvonne Hsu 許勻菲博士

台灣默克生命科學事業體

專精領域：

在比較離子對試劑FA, TFA (如下圖) 所使用的C18本身是由di-isobutyl-octadecylsilane鍵結相構成立體空間保護的非封尾管柱

而在 ion pairing reagent 結合不同靜相比較時(如下圖)，所使用的 C18 是有封尾的，因為其他靜相皆封尾，方能比較。

管柱的封尾主要是要減少自由Si-OH的反應性以及保護silica support。然而，封尾的管柱也可能對氫鍵受體（如: 游離鹼基）的滯留較差，對質子化鹼基的滯留增加，因此仍需視您的分析物本身性質是否容易受到影響，這可由圖譜的結果觀察。

選用離子對試劑時，同時須考慮偵測器類型，如果同時要使用 UV 與 MS 偵測，DFA 是比 TFA 和 FA 更可使用的移動相添加劑替代品
DFA 提供比 FA 更好的分離效率，並且不會像 TFA 那樣對質譜分析引起強烈的離子抑制效應
分析 peptides 或是 mAb 必須考慮溫度的影響，因為大分子 diffusion kinetics 較慢，需提高管柱溫度，避免其在管柱內停留太久，產生 artifact 或是recovery 差
選擇不同管柱靜相時需同時考量所搭配的離子對試劑，如果我們選擇不同管柱化學搭配 「不影響或干擾」靜相選擇性的離子對試劑，可以得到很好的方法正交性，提升 sequence coverage %
DFA 雖然可提升efficiency 但同時也會遮蔽來自管柱所貢獻不同靜相的選擇性，而影響 resolution，因此，進行層析時 efficiency 與 resolution 需兩相權衡
使用快速蛋白質分解酵素也可以減少 artifact

HILIC 相關型錄